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你的细胞受到支原体污染了么?
发布时间:2015-04-28        浏览次数:390        返回列表

细胞培养被支原体污染是个世界性问题,在细胞培养中支原体感染发生率达到63%。支原体是一类无细胞壁,形态呈高度多形性,为圆形、丝状或梨形,其直径仅有0.13~0.18μm,变形能力大,故能通过滤菌器,最突出的结构特征是没有细胞壁,对作用于细胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明,支原体能耗尽营养物,促进代谢积累,导致pH改变,对细胞造成多种影响,包括生长状况、生化特性、代谢、免疫、以及细胞存活等多方面的改变,继而干扰实验结果,或造成无法解释的差异。更加不幸的是拯救被感染的细胞几乎是不可能的。那如何检测你的细胞是否收到支原体的入侵呢?下面介绍了几种检测方式,或许对你的实验有用。

 

分离培养法

分离培养法是支原体检测的金标方法,其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样,并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体,它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长,最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果,因此被誉为支原体检测金标准。

但是,分离培养法也存在两个弊端,一是检测时间太长,支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类,分离培养法也有力所不及的时候,例如支原体M. hyorhinis。

 

DNA检测法,也称直接培养法

将可疑样品与指示细胞共同培养,一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞,如果原样本中含有支原体,那么当细胞DNA被荧光染料(如Hoechst染料)染色时,就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。

但是这种方法灵敏度太低,当检测成阳性时,细胞经常已经严重污染。且Hoechst荧光染色:操作复杂,操作不当易造成假阳性或假阴性。 

 

PCR

市面上有许多商机提供基于PCR的支原体检测试剂盒,如GeneCopoeia。这种方法已经比较成熟,应用的范围也较为广泛。

 PCR法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本,其PCR引物可特异扩增支原体基因组中rDNA保守序列,包括所有已知的支原体,及细胞培养过程普遍遇到的种属,例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium U. urealyticum。在凝胶电泳过程中,支原体DNA会显示为特异性条带,以此指示支原体的存在。

PCR法快速,简便,具有强扩增能力和极高的敏感性,可以检测大多数支原体,但谨慎起见最好同时使用另一种检测方法来进行验证。PCR法检测支原体只需几个小时,是最快但也是最不灵敏的支原体检测方法。 

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酶学检测

酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中,在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP,随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。国内GeneCopoeia有这类检测试剂盒,具体可以详细咨询他们    

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最后,建议你进行定期检测

支原体感染会影响细胞的正常生长,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

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